文|面包夾知識

編輯|面包夾知識

«——【·前言·】——»

集約化水産養殖通常使用化學物質和抗生素防控細菌、真菌、病毒和寄生蟲等引起的疾病。但抗生素導致的食品安全問題愈發嚴重。

因此尋找安全有效的抗生素替代品對于水産養殖的可持續發展非常重要。

益生菌具有安全、有效、無殘留、無汙染等優點，芽孢杆菌、乳球菌、酵母菌、腸球菌和乳杆菌屬等益生菌，能夠通過體內定植影響水産動物腸道微生物群落結構。

改善消化吸收與代謝功能，提升免疫水平與預防疾病，進而促進魚蝦生長，保障水産動物健康養殖。

不過，北京一科學研究基地發現，乳酸杆菌（Lactobacillus）可改善腸道微生態環境，增強腸道上皮細胞的屏障層功能，提高動物的免疫功能等，在動物生産中發揮益生素的作用。

在飼料中添加單一乳酸杆菌或含有乳酸杆菌的益生元可提高水産動物成活率，促進其生長，增加腸道有益菌數量。

紅螯螯蝦隸屬十足目、擬螯蝦科、滑螯蝦屬，具有食性雜、生長快、高産、環境耐受性廣、肉質細嫩、味道鮮美、出肉率高及觀賞性強等優點。

以紅螯螯蝦爲研究對象，探究飼料中添加乳酸杆菌對其生長性能和腸道微生物群落結構的影響，爲紅螯螯蝦的健康養殖提供參考。

«——【·材料與方法·】——»

乳酸杆菌是經過篩選保留下來的菌種（活菌數爲1.8×109CFU/mL）。在營養肉湯（NB）培養基、營養瓊脂（NA）培養基中進行菌種活化、擴培，得到活性菌種，用于後續試驗。

紅螯螯蝦爲實驗室自繁蝦苗。選取600尾健康無病、初重（0.55±0.05）g的蝦苗，隨機分爲4組，每組3個重複，每個重複50尾蝦苗。

基礎飼料爲上海紅馬飼料有限公司生産的淡水小龍蝦配合飼料，營養水平爲粗蛋白32%、粗脂肪5%、賴氨酸1.3%、總磷1.0%。

將活菌數爲1.8×107CFU/mL的PBS乳酸杆菌菌液添加到紅螯螯蝦基礎飼料中，添加量分別爲0（CA組）、1.8×105（TB組）、1.8×106（TC組）、1.8×107CFU/g（TD組），試驗期45d。

養殖試驗，在日照職業技術學院水生物養殖實訓中心，循環水系統中進行。

每個養殖缸爲1個重複，養殖缸內放置遮蔽物，養殖用水爲曝氣自來水，水溫25~26℃，溶解氧大于5mg/L，每天投飼2次（7：00、17：00），投飼30min後，虹吸出糞便和殘餌。每天觀察蝦的生長情況、健康狀態及蛻殼情況等。

PCR産物使用濃度爲2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳回收PCR産物，利用GeneJET膠回收試劑盒進行純化。

對IlluminaNovaSeq測序得到的下機數據（RawPE）進行拼接和質控，得到Cleanags，再進行嵌合體過濾，得到有效數據，用于後續分析。

試驗數據采用SPSS21.統計分析程序軟件進行分析，Duncan's 法進行多重比較。結果以“平均值±標准誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

«——【·結果與分析·】——»

乳酸杆菌對紅螯螯蝦生長性能和飼料效率的影響由表1可知，紅螯螯蝦成活率爲83.33%~85.33%。

TB組和TC組紅螯螯蝦的末重、增重率和特定生長率顯著高于CA組（P<0.05），TC組紅螯螯蝦的飼料系數顯著低于CA組（P<0.05）。

與TC組相比，TD組紅螯螯蝦的生長性能未得到進一步改善。

基于IlluminaNova測序系統及數據分析，平均每個樣本測得82540條tags，質量檢測後平均得到76811條有效數據，有效數據總數超過51646條，質控有效率超過67.24%。

通過排序後在數據庫上完成物種注釋。在所有注釋結果中，共有1166個OTU注釋到種屬水平，基于Chao1指數創建樣品稀釋曲線，結果見圖1。

由圖1可知，隨著測序數量的持續增加，各采樣曲線都達到平台期，表明測序深度基本能夠涵蓋全部試驗樣本的所有微生物種類。

各個樣本測序的平均覆蓋度均在0.996以上，也表明測序基本包含了試驗樣本中的全部微生物種類。

由圖2可知，試驗第15d，TB組、TC組的Shannon、Simpson指數均大于CA組，即TB組和TC組腸道菌群數量及物種多樣性的均勻性均明顯優于 CA 組。

試驗第45d，各試驗組的Shannon、Simpson指數均大于CA組，即試驗組的生物多樣性和均勻度明顯優于CA組。

由圖3可知，紅螯螯蝦的腸道主要功能菌由放線菌門、擬杆菌門、厚壁菌門和變形菌門組成。

變形菌門幾乎在所有組中占據優勢地位，其次是厚壁菌門。由圖4可知，紅螯螯蝦腸道優勢菌科主要是紅杆菌科（Rhodobacteraceae）和氣單胞菌科（Aeromonadaceae）。

由圖5可知，紅螯螯蝦腸道優勢菌屬爲副球菌屬（Paracoccus）和氣單胞菌屬（Aeromonas）。

在門水平上，與CA組相比，TB和TC組放線菌門（Actinobacteriota）的相對豐度明顯升高，TD組放線菌門相對豐度也升高。

在科水平上，與CA組相比，試驗組紅杆菌科的相對豐度均升高，氣單胞菌科（Aeromonadaceae）的相對豐度均降低。

在屬水平上，與CA組相比，試驗組副球菌屬（Paracoccus）的相對豐度均升高，氣單菌屬（Aeromonas）的相對豐度均降低。

與CA組相比，TC組氣單胞菌科的相對豐度升高，TB和TD組氣單胞菌科的相對豐度降低。

在屬水平上，與CA組相比，TB和TC組副球菌相對豐度降低，TD組副球菌屬相對豐度升高，與CA組相比，TB和TD組氣單胞菌屬的相對豐度降低，而TC組氣單胞菌屬的相對豐度升高。

在門水平上，與CA組相比，TB組與TC組放線菌門的相對豐度降低，TD組放線菌門的相對豐度升高，TC組和TD組擬杆菌門相對豐度升高，試驗組的變形菌門相對豐度均升高。

在科水平上，與CA組相比，TB組紅杆菌科的相對豐度降低，TC組和TD組紅杆菌科的相對豐度升高。

與CA組相比，試驗組氣單胞菌科的相對豐度均升高。在屬水平上，與CA組相比，TB組副球菌屬的相對豐度顯著降低。

TC組、TD組副球菌屬的相對豐度升高，TB組氣單胞菌屬的相對豐度升高，TC組、TD組氣單胞菌屬的相對豐度明顯升高。

«——【·討論·】——»

乳酸杆菌對紅螯螯蝦生長性能和飼料效率的影響益生菌能夠通過改變宿主或環境微生物群落、提高飼料營養價值。

增強宿主對疾病的反應或改善養殖環境等路徑對宿主産生有益影響。生長性能是評價益生菌效果的主要指標之一。

乳酸菌可以顯著改善羅非魚、黑鲷、建鯉、細鱗鲑和大口黑鲈的生長性能，提高飼料利用率，增強抗氧化和免疫力，改善腸道健康。

本試驗中，飼料添加1.8×106CFU/g乳杆菌可以顯著提高紅螯螯蝦的末重、增重率和特定生長率，降低飼料系數。

有研究表明，飼料添加1.5×107CFU/g乳酸乳球菌顯著提高了紅螯螯蝦的生長性能和肝胰腺組織消化酶活性。

研究表明，飼料中分別添加0.5%植物乳酸杆菌和1.0×1010CFU/kg不同乳酸菌均可促進凡納濱對蝦的生長。

乳酸杆菌對生長的益生作用可解釋爲産生水解酶（包括澱酵酶和蛋白酶）和維生素（如VB12）、消除飼料中有害物質的影響、刺激消化酶分泌、維持腸道菌群，從而改善營養吸收和促生長。

乳酸杆菌對紅螯螯蝦腸道微生物多樣性的影響腸道菌群對動物的生長發育、消化、免疫力等均具有重要影響，通常被作爲水生動物健康狀況的綜合指標。

魚蝦類腸道微生物的組成受到發育階段、水環境、餌料成分及投餵策略等多種因素的影響，菌群結構的改變會間接影響魚蝦健康。

根據實驗科學家發現，飼料中添加乳酸杆菌明顯改變了紅螯螯蝦腸道的菌群結構，添加1.8×105CFU/g和1.8×107CFU/g乳酸杆菌時，紅螯螯蝦的腸道菌群多樣性和豐度均升高。

也有研究表明：飼料中添加1.0×1010CFU/kg的嗜酸乳杆菌、糞腸球菌和凝結芽孢杆菌均明顯改善了凡納濱對蝦腸道微生物群落的組成和豐度。

在門水平上，變形菌門、厚壁菌門和擬杆菌門爲對蝦腸道優勢菌群；在綱水平上，α-變形菌綱、丹毒絲菌綱和黃杆菌綱爲優勢菌群。

池塘養殖中華絨螯蟹的腸道內益生菌定植較差，短期施用益生菌可以顯著改變微生物群落β-多樣性，促進腸道菌群的丁酸鹽代謝。

枯草芽孢杆菌顯著提高了牛蛙腸道菌群的豐度和多樣性。

凡納濱對蝦腸道菌群中的核心菌門包括擬杆菌、變形杆菌、厚壁菌和放線杆菌，變形杆菌是對蝦腸道的主要細菌。

飼料添加乳酸杆菌可以明顯提高紅螯螯蝦消化道放線菌門、擬杆菌門、厚壁菌門和變形菌門等優勢菌門的菌群相對豐度，其中變形菌門是腸道的主要菌群。

擬杆菌、厚壁菌和放線菌通過影響代謝活動的方式在維護宿主健康的生理學方面發揮重要作用，發酵宿主體內的不可消化碳水化合物，産生短鏈脂肪酸。

放線杆菌是能夠産生酚氧化酶的有益菌，酚氧化酶分泌抗菌、抗氧化劑以及黏蛋白，從而保護宿主的正常腸道機能。

飼料中添加植物乳杆菌養殖細鱗鲑，通過多樣性分析發現，在門水平上，腸道菌群以變形菌門、厚壁菌門和藍細菌門爲主。

有研究發現，飼料中添加乳酸乳球菌可以顯著提高紅螯螯蝦的腸道有益菌豐度，降低潛在致病菌的豐度。

例如，有研究發現，添加微生物制劑可以明顯提高小龍蝦腸道內細菌生物多樣性和豐度，腸道優勢菌群爲變形菌門，厚壁菌門相對豐度由6.10%提高至14.21%，有害菌群弧菌屬數量由10.11%降低至4.68%，腸道菌群趨向豐富和穩定。

另外，有研究在飼料中分別添加枯草芽孢杆菌、3%光合細菌、0.1%複合菌劑、乳球菌屬也得到了類似的結果。

在飼料中添加乳酸杆菌可以改善紅螯螯蝦養殖過程中的健康狀況，有利于生長發育。

飼料中添加乳酸杆菌後，在紅螯螯蝦腸道的定植微生物群中，隸屬于α-變形菌綱的紅杆菌科的豐度較大，而氣單胞菌屬的相對豐度均有所降低。

紅杆菌科菌株能夠産生聚羟基丁酸酯，對魚蝦的生長與發育具有潛在的促進作用，海洋玫瑰杆菌已經被作爲有益菌用于水産養殖。

氣單胞菌普遍存在于水生生物腸道中，是消化道細菌的正常組成成分，屬于條件病原菌，在特定環境情況下可導致宿主感染，嚴重時導致宿主死亡。